A római egyetem bölcsészkarán tanult filozófiát, 1943-ban doktorátust is szerzett. A színészettel az egyetemi diáktársulatnál kezdett foglalkozni, majd egy kis színházban egyszerre volt balerina, zenész, énekes és színész. 1943-ban egy rádiós hangjáték főszereplőjeként ismerkedett meg a szerzővel, Federico Fellinivel, akivel 13 nappal később összeházasodtak; nászútjuk abból állt, hogy megnézték barátjuk, Alberto Sordi egyik előadását.

Masina a háború utáni olasz neorealista filmek egész sorában játszott főszerepet, de igazi sikereit férje irányítása alatt aratta. Először Roberto Rossellini Paisájában (1946) tűnt fel a filmvásznon statisztaként. A figyelmet a Nincs irgalom című film esetlen kis prostituáltjaként hívta fel magára, ezt követte A varieté fényei, Lattuada és Fellini filmgyártó vállalkozásának első és egyben utolsó filmje, amelyben a Masina által alakított segédszínésznő személyében először tűnik fel az önzetlen szeretet, mint a magány lehetséges orvoslása. 1952-ben szerepelt férje első önálló rendezésében (A fehér sejk).

A világsikert az Országúton (1955) hozta meg, Fellininek rendezőként, neki főszereplőként: a tragikomikus, kiszolgáltatott sorsú, szánni valóan esendő, mégis költőien tiszta Gelsominát formálta meg. A film megkapta a velencei filmfesztivál Ezüst Oroszlán díját és a legjobb külföldi filmnek járó Oscar-díjat. Fellini utolsó fekete-fehér - szintén Oscar-díjas - filmje, a Cabiria éjszakái címszerepéért - a jövőben állandóan bizakodó egyszerű, tiszta lelkű római utcalány megformálásáért - elnyerte a cannes-i filmfesztivál legjobb színésznőnek járó díját. Övé volt a főszerep férje első egész estét betöltő színes mozijában, a Júlia és a szellemekben is.

A házaspár csak húsz év múlva forgatott ismét együtt, mert Masina 1970-ben visszavonult és csak a tévében vállalt föllépést. 1985-ben férje Ginger és Fred című alkotásában Marcello Mastroiannival egy megkopott, tragikomikus táncospárt formált meg, utoljára 1991-ben Louis Bertucelli kevéssé ismert Talán ma című filmjében szerepelt a vásznon.

Fellini megfogalmazása szerint feleségében "az elveszett ártatlanság fölötti sajnálkozás vagy az elárult ártatlanság érzése" hatotta meg leginkább, ő képezte számára a "tökéletes erkölcs iránti nosztalgiát". Masina hitelesen formálta meg az alázatos és szomorú nőket. Elbűvölő mosolya, kifejező gombszemei, világra csodálkozó tekintete, bohócos arca, törékeny alakja, alakításaiból tükröződő erkölcsi tisztasága anélkül érzékeltette a figura elesettségét és emberségét, hogy érzelgős lett volna.

A házaspár öt évtizedet élt boldog házasságban. Utolsó közös fellépésük 1993-ban Los Angelesben volt, amikor Fellini átvette az életművéért járó Oscar-díjat. A rendező akkor azt vallotta, mindent feleségének köszönhet. Fellini néhány hónappal később, éppen házassági évfordulójukon meghalt, a veszteségen magát túltenni nem tudó Giulietta Masina alig öt hónappal élte túl: 1994. március 23-án, 73 éves korában hunyt el Rómában.