1863. január 17-én Moszkvában született nagypolgári családban. Amatőr színészként a Sztanyiszlavszkij álnevet választotta magának. 1888-ban barátaival megalapította a Moszkvai Művészeti és Irodalmi Társaságot, ahol műkedvelő színielőadásokat rendeztek. 1897-ben ismerkedett meg Vlagyimir Nyemirovics-Dancsenkóval, a cári Kis Színház egyik vezetőjével, a Moszkvai Filharmóniai Társaság színiiskolájának tanárával. Nyemirovics-Dancsenko, aki elégedetlen volt a századvég sablonos, kötöttségekbe merevedett színjátszási szabályaival, új stílust keresett, s az erre alkalmas partnert Sztanyiszlavszkijban látta meg. Közösen fogalmazták meg egy reformszínház, a későbbi Művész Színház alapgondolatát. A Moszkvai Művész Színház első gárdája Nyemirovics-Dancsenko kimagaslóan tehetséges végzős osztályából, Sztanyiszlavszkij műkedvelőiből és köréjük toborzott külsősökből jött létre. Sztanyiszlavszkij főleg rendezéssel és színészképzéssel foglalkozott. Első előadásuk Alekszej Tolsztoj Fjodor Ioannovics cár című drámája volt. 

Az igazi sikert egy nagyon bátor vállalkozás, Anton Csehov - a pétervári színházban korábban megbukott - Sirályának színpadra vitele volt 1898. december 17-én. Sztanyiszlavszkij írta a rendezőpéldányt, újításai már ezen megmutatkoztak, s ezzel a bemutatóval megszületett a modern orosz színjátszás. A Sztanyiszlavszkij-féle színjátszás, a realista szerepalkotás róla elnevezett tudományos rendszere arra épült, hogy a színészi játék alapja a szerep teljes érzelmi és gondolati átélése. Ehhez a színész a szerepével való azonosulási gyakorlatok során végzett lélektani elemzés révén jutott el.

A Sirály sikeres előadása több Csehov-dráma színpadra vitelére ösztönözte a rendezőt, így került színre a Ványa bácsi, a Cseresznyéskert, a Három nővér és az Ivanov. Első híresebb és emlékezetes rendezései közé tartozott Ibsen Hedda Gabler (1899) című műve, valamint Gorkij Kispolgárok (1902) és Éjjeli menedékhely (1902) című darabjai. Az 1920-as években a társulat két alkalommal Budapesten is megfordult.

A századforduló színházművészetének egyik legmeghatározóbb egyéniségét 1938-ban Moszkvában érte a halál, irányelvei és tanításai - melyek túlmutattak a maguk korán - azonban "túlélték" megálmodójukat, s mindmáig hatással vannak a világ színművészetére.